关键指标的检测方法

1 氨基酸态氮（甲醛滴定法）

原理：氨基酸为两性电介质。在接近中性的水溶液中，全部解离为双极离子。当甲醛溶液加入后，与中性的氨基酸中的非解离型氨基反应，生成单羟甲基和二羟甲基诱导体，此反应完全定量进行。此时放出氢离子可用标准碱液滴定，根据碱液的消耗量，计算出氨基态氮的含量。

实验步骤：

（1）称取样品5g（精确至0.0002g），加水溶解并定容至100mL。

（2）吸取样品溶液5.0mL于100mL烧杯中，加水55mL，用氢氧化钠标准滴定溶液滴定pH=8.20，并保持1min不变，此结果为游离酸度，不予计量体积。

（3）然后慢慢加入甲醛溶液10mL，放置1min后，用氢氧化钠标准滴定溶液滴定至pH=9.20，记录消耗氢氧化钠标准滴定溶液的毫升数。

（4）同时做空白试验，记录加入甲醛溶液后，空白试验所消耗氢氧化钠标准滴定溶液的毫升数。

2氨基酸（GB/T 18246-2000 饲料中氨基酸的测定）

（1）准确称量样品（样品游离氨基酸范围10-20mg），用pH2.2的缓冲液定容至50mL。

（2）吸取0.200mL混合氨基酸标准液，用标准液稀释到5mL，此时浓度5.00nM/50μL，作为上级测定用标准氨基酸液。

（3）用氨基酸自动分析仪以外标法测定试样测定液中氨基酸含量。

3酸溶蛋白、小肽（ “GB/T 22492-2008 大豆肽粉”测定方法）

原理：高分子蛋白质在酸性条件下易被沉淀，相对分子质量较小的蛋白质水解物（酸溶蛋白）可溶于酸性溶液（包括肽和游离氨基酸）。

实验步骤：

（1）准确称取样品1.000g，加入15%三氯乙酸溶液定容至50mL，混匀静置5min，去除初滤液，滤液备用。

（2）吸取10-20mL滤液，移入定氮瓶，加入0.2g硫酸铜，6g硫酸钾和20mL硫酸，摇匀后置于45°斜于有小孔的石棉网上。加热至内容物完全碳化，无泡沫后加强火力，保持微沸，至液体呈蓝绿色透明液后继续加热0.5h-1h。取下放冷加入20mL水。放冷后，用容量瓶配置100mL溶液，水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶，混匀备用。同时做试剂空白试验。

（3）测定，按要求接定氮装置，于水蒸气发生瓶内装水至三分之二处，加入适量玻璃珠，加入甲基红指示液数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，用调压器控制，加热煮沸发生瓶内的水。

（4）向接受瓶内加入10mL硼酸溶液（20g/L）及1-2滴混合指示剂，插入冷凝管，取10mL试样处理液加入反应室，加10mL水洗流加口，塞紧瓶塞口，加水于小烧杯防止漏气。加进螺旋夹，开始蒸馏。蒸馏5min。移动接受瓶，使液面离开冷凝管下端再蒸馏1min。然后少量水冲洗冷凝管下端外部，取下接受瓶，滴加指示剂，以硫酸或盐酸滴定液（0.05M）滴定至灰色或蓝紫色为终点。同时取10mL试剂空白消化液按同样步骤操作。

4 RNA（分光光度计法）

实验步骤：

（1）准确称取样品到离心管；

（2）酸提取；

（3）离心，取上清液，稀释定容，混匀；

（4）在260nm测光吸收值，用蒸馏水作为空白。

5 甘露聚糖和β-葡聚糖（高效液相法）

原理：根据葡萄糖和甘露糖在流动相和液相色谱柱的固定相之间具有不同的分配系数，将水解后的样品注入液相色谱，用纯水做流动相，糖类分子流出后，经示差检测器检测，用外标法定量。在β-葡聚糖和甘露寡糖水解时，由于样品可能存在水解不彻底，以及水解产生的葡萄糖和甘露糖由于高温造成部分发生其它副反应，导致检测结果比产品中实际含有的β-葡聚糖和甘露寡糖偏低。检测中采用葡聚糖对照品对上述水解过程引起的误差进行修正。

样品处理：准确称取样品放入一个20ml的耐热玻璃制的带螺帽的小试管中，加入盐酸水解，得到均一的悬浮液。水浴处理45min。然后将悬浮物分几次洗涤小试管，洗涤液并入杜氏瓶中。将杜氏瓶放入高压灭菌锅处理60min。取出后冷却，用氢氧化钠溶液将溶液调PH到6～7，然后定容至200ml。使用0.45微米孔径的醋酸纤维素膜过滤备用。同时准确称取葡聚糖对照品，按样品处理方法进行同样的处理。

标准曲线绘制：略。

样品及其对照品测定：在同样的色谱条件下，将处理好的样品和葡聚糖对照品分别注入色谱仪中，记录各色谱峰的保留时间和峰面积。用糖标样色谱峰的保留时间定性，用糖标样色谱峰的峰面积来定量。

6 总硒（GB/T 13883-2008饲料中硒的测定）

原理：试样经酸加热消化后，在盐酸介质中，将试样中的六价硒还原成四价硒，用硼氢化钠做还原剂，将四价硒在盐酸介质中还原成硒化氢，有载气带入原子化器中进行原子化，在硒空心阴极灯照射下，基态硒原子被激发至高能态，在去活化回到基态，发射出特征波长的荧光，其荧光强度和硒含量成正比，与标准系列比较定量。

样品处理：准确称取2.0g（精确至0.0001g），置于100mL高型烧杯内，加入15.0mL混合酸溶液以及几粒玻璃珠，盖上表面皿冷消化过夜。次日于电热板上加热，当溶液高氯酸冒烟时，再继续加热至剩余体积2mL左右，切不可蒸干。冷却，再加2.5mL盐酸，用水洗吹表面皿和杯壁，继续加热至高氯酸冒烟时，冷却，移入50mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为试样消化液。量取20mL试样消化液与50mL的容量瓶中，加8mL盐酸，加2mL铁氰化钾溶液，用水稀释至刻度摇匀，待测。同时在相同条件下，做试剂空白试验。

标准曲线绘制：分别准确称量0.0，0.25，0.50，1.00，2.00，3.00mL硒标准工作液于50mL容量瓶中，加入10mL水，加入8mL盐酸，加2mL铁氰化钾溶液，用水稀释至刻度，摇匀。

样品测定：设定好仪器最佳条件，待炉温升至设定温度后，稳定15min-20min开始测量。连续用标准系列的零瓶进样，待读数稳定之后，首先进行标准系列测量，绘制标准曲线。在转入试样测量，分别测量试样的空白和试样，在测量不同的试样浅进样器要清洗。测其荧光强度，求出线性回归方程各参数或绘制出标准曲线，从标准曲线上查的溶液含硒量。

7 硒代蛋氨酸

原理：试样经蛋白酶酶解，再经衍生化试剂衍生，衍生产物采用选择离子监测质谱扫描模式（SRM），用化合物的保留时间和质谱碎片的丰度比定性，内标法定量。

实验步骤：

（1）配制硒代蛋氨酸标准溶液；

（2）硒代蛋氨酸衍生化；

（3）样品处理及衍生化； 

（4） GC/MS分析测定。